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載體構(gòu)建克隆

更新時間:2024-09-26

簡要描述:

載體構(gòu)建克?。╲ectorconstruction),為把DNA分子運送到受體細胞中去,必須尋找一種能進入細胞、在裝載了外來的基因片段后仍能照樣復(fù)制的運載體。理想的運載體是質(zhì)粒(plasmid),在基因工程中,常用人工構(gòu)建的質(zhì)粒作為載體。載體構(gòu)建即是構(gòu)建含外源DNA的質(zhì)粒。

  載體構(gòu)建克隆(vectorconstruction)是分子生物學(xué)研究常用的手段之一。依賴于限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶和其它修飾酶的作用,分別對目的基因和載體DNA進行適當(dāng)切割和修飾后,將二者連接在一起,再導(dǎo)入宿主細胞,實現(xiàn)目的基因在宿主細胞內(nèi)的正確表達。載體構(gòu)建主要包括已有載體多克隆位點MCS的改造和已有載體啟動子、增強子、篩選標(biāo)記等功能元件的改造。載體構(gòu)建完成后可利用PCR原理進行測序驗證。

  載體構(gòu)建克隆實驗步驟:

  1)引物設(shè)計,PCR擴增目的片段

  2)酶切目的片段與載體

  3)連接或重組

  4)載體構(gòu)建轉(zhuǎn)化

  5)涂板

  6)挑取克隆酶切或PCR鑒定

  7)載體構(gòu)建測序驗證


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